Dr. Ari Eszter1,2,3, Dr. Vásárhelyi Bálint Márk1, Dr. Kemenesi Gábor4, Tóth Endre Gábor4, Prof. Dr. Jakab Ferenc4, Dr. Papp Balázs1,2, Dr. Kintses Bálint1,2
- Eötvös Loránd Kutatási Hálózat, Szegedi Biológiai Kutatóközpont
- Magyar Molekuláris Medicina Kiválósági Központ, HCEMM Nonprofit Kft.
- Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar
- Pécsi Tudományegyetem Szentágothai János Kutatóközpont, Virológiai Nemzeti Laboratórium
A koronavírus-fertőzés terjedési láncának visszakövetésében és a klinikai fejlesztés alatt álló vakcinajelöltek várható hosszú távú hatékonyságának előrejelzésében is segíthet az a vírusgenom-kutatási program, amely konzorciális együttműködéssel, szegedi, pécsi, debreceni és budapesti kutatóintézetek és klinikák közreműködésével valósul meg, és bekapcsolja hazánkat a COVID-kutatás nemzetközi kollaborációjába. A vírus teljes genetikai állományának (genomjának) vizsgálata más járványtani elemzésektől független információforrás, amellyel reprodukálható a COVID-19-járvány tavaszi-koranyári hulláma, és megtudható, milyen vírusváltozatok terjednek jelenleg az országban. A projekt legfrissebb eredményei alátámasztják, hogy a SARS-CoV-2 fertőzés hazai második hulláma független a tavaszi járványterjedéstől: a jelenlegi járványügyi helyzet nem a tavaszi időszakban kialakult és lappangva terjedő fertőzési láncok folytatása, hanem a nyár közepén történt újbóli behurcolások eredménye. A genomszekvenálással feltárt vírusváltozatok összehasonlító elemzése arra is egyértelműen rámutat, hogy amíg a hatékony korlátozások következtében a tavaszi első fertőzéshullám lokális maradt, addig az őszi szakaszban már országos kiterjedésű láncolat is létrejött, ami megerősíti a belföldi széthurcolás szerepét és alátámasztja, hogy a járványügyi korlátozások kulcsfontosságúak a fertőzés terjedésének megakadályozása, illetve lassítása szempontjából. A Magyarországon jelenleg terjedő fertőzési láncokat kialakító vírusváltozatok alapvetően megegyeznek az Európában terjedő vírusvariánsokkal: a mostani járványhullámot olyan változatok dominálják, amelyek a tavasz során más európai országokban alakultak ki. A hazai vírusváltozatokkal kapcsolatos adatok fontos elemei a nemzetközi vírusmonitorozásnak, mivel a COVID-19 megbetegedést okozó SARS-CoV-2 vírussal kapcsolatos ismeretek bővítése révén segítik a jövőbeli járványügyi helyzetekre való felkészülést. Emellett, a genetikai változások (mutációk) nyomon követése azért is fontos, hogy a vakcinák, terápiák és diagnosztikai tesztek várható hatékonyságát megítéljük.
Azóta, hogy 2019 decemberében felütötte fejét a SARS-CoV-2-ként (SARS-CoV-2: súlyos akut légúti tünetegyüttest okozó koronavírus 2-es típusa) számon tartott, új típusú koronavírus, világszerte rendkívüli ütemben nő a fertőzöttek száma. Az Egészségügyi Világszervezet november 29-i statisztikai adatai szerint világviszonylatban közel 62 millió fertőzöttet tartanak nyilván, és csaknem 1,5 millió haláleset következett be a koronavírus-fertőzés szövődményei miatt. Összehasonlításként, a védőoltással megelőzhető szezonális influenzavírus-fertőzéssel összefüggő éves halálozást világviszonylatban 650 000 körülire becsülik, és a 2009-ben világjárványt (pandémiát) okozó H1N1 influenzavírus első éves halálozási száma sem haladta meg a 400 000 főt. Hazánkban a regisztrált koronavírus-fertőzöttek száma megközelíti a 220 000 főt, a mostanáig elhunytak száma pedig majdnem 5 000.
A nemzetközi kutatások egyik fókuszpontja a fertőzés terjedési láncolatának és a vírus természetszerű változásainak nyomon követése, ami egyfelől az eddigi tapasztalatok értelmezése, másfelől a jövőben várható új helyzetek előrejelzése és az azokra való globális felkészülés szempontjából kiemelt jelentőségű. A járványügyi monitorozás kulcsfontosságú eszközei az ún. vírusgenomikai vizsgálatok, amelyek során a kórokozó örökítőanyagát (genomját) és annak változásait elemzik. Az örökítőanyag természetes változásai (mutációi) fontos szerepet játszanak a vírus életképességében és fertőzőképességében, így döntő hatással vannak (vagy lehetnek) a kezelési és a megelőzési stratégiák hatékonyságára. Nélkülözhetetlen tehát, hogy ismerjük és folyamatosan kövessük a kórokozó változásait – mutatnak rá a tudományos munka össztársadalmi jelentőségére a hazai koronavírus-genomkutatási program vezetői, dr. Kintses Bálint és dr. Papp Balázs, az Eötvös Loránd Kutatási Hálózathoz tartozó Szegedi Biológiai Kutatóközpont (ELKH-SZBK) és a Magyar Molekuláris Medicina Kiválósági Központ (HCEMM) munkatársai, illetve prof. dr. Jakab Ferenc és dr. Kemenesi Gábor, a Pécsi Tudományegyetemhez tartozó Virológiai Nemzeti Laboratórium vezetői.
Miről árulkodnak a vírusgenomikai vizsgálatok?
Terjedése során a SARS-CoV-2 koronavírus már rövid távon is mutációkat halmoz fel (a genom módosulásának üteme nagyjából kéthetente 1 mutáció), amelyek a fertőzöttek szervezetéből kimutatott kórokozók genetikai vizsgálatával nyomon követhetők. A mutációk követése két okból is fontos része a koronavírus elleni küzdelemnek – hangsúlyozzák a kutatók. Egyrészt, a mutációk időbeli és térbeli mintázata fontos információt ad a járvány terjedéséről: az adatokból kirajzolódó ún. evolúciós törzsfa (filogenetikai fa) elemzésével megbecsülhető például, hogy (legkevesebb) hány független behurcolása történt a vírusnak, mi volt az egyes gócpontok földrajzi forrása, nagy pontossággal becsülhető a fertőzési gócok kialakulásának időpontja és meghatározható a vírus terjedési üteme. Mindemellett a fertőzés terjedési útvonaláról is sokat elárul.
1Meg kell jegyezzük, hogy a timin az eredeti vírusgenomban, a DNS-re történő fordítás előtt U, azaz uracil volt.
Másfelől, a mutációs mintázat képet ad a kórokozó biológiai viselkedését befolyásoló genetikai változások megjelenéséről és terjedéséről is. Habár a jelenlegi ismereteink szerint a mutációk zöme nem befolyásolja érdemben a vírus biológiai jellemzőit, lehetnek – és igazoltan vannak – olyan genetikai módosulások, amelyek megváltoztatják a SARS-CoV-2 vírus fertőzőképességét vagy szervezetbeli viselkedését – például azáltal, hogy segítenek elkerülni az immunrendszer védekezését – így a betegség kórlefolyására is hatással lehetnek [1]. Jó példája ennek a vírus felszíni S-tüskefehérjéjének módosulása a fehérjét kódoló gén megváltozása (N439K mutáció, részletesen ld. alább) miatt, ami elősegíti, hogy a szervezetbe került kórokozó kitérjen az immunrendszer általi felismerés elől). A gazdaszervezet immunvédekezésének eredményességét befolyásoló vírusmódosulások a védőoltások fejlesztése szempontjából is kiemelten fontosak lehetnek, ugyanis megjelenhetnek olyan génváltozatok, amelyek ellenállóvá (rezisztenssé) teszik a vírust az oltással szemben. A mutációk hasonló problémát okozhatnak a fertőzés által kialakított védettségünk, vagy az ún. antitest-terápia eseteiben is, ugyanis, a vírus fehérjéihez (antigének) kötődő antitestek hatékonysága a szervezetben szaporodó SARS-CoV-2 vírus semlegesítésén alapul. Ehhez azonban kulcsfontosságú a vírusantigének és az őket lefedő antitestek (szintén bonyolult fehérjemolekulák) szerkezeti illeszkedése – lényegében a zár és a kulcs elve szerint [2]. Ha tehát a terápiás célpontként szolgáló vírusantigén-fehérje jelentősebb változáson megy át egy génmutáció következtében, akkor az addig eredményesen alkalmazható antitestek hatásosságának romlásával vagy akár hatásvesztésükkel is szembesülhetünk. Ennek a folyamatnak a következtében nagyobb eséllyel eshet át valaki újabb fertőzésen, a korábbi vírusváltozatokkal szemben kialakult védettség ellenére, legyen az oltás vagy korábbi fertőzés következtében kialakult védelem.
Független információforrás
Fontos hangsúlyozni, hogy a vírus teljes genetikai állományának (genomjának) vizsgálata más járványtani elemzésektől független információforrás, és a világban sok helyütt sikerrel használták fel, nemcsak a jelenleg is zajló SARS-CoV-2 járvány esetében, hanem korábban például az ebola- vagy influenzajárványok során. A konzorciális együttműködéssel folyó hazai tudományos munka célja, hogy a kutatócsoportjaink evolúciós és bioinformatikai tudására építve a hazai koronavírus-genomok gyors, valós idejű vizsgálatával új információt nyerjünk a járvány magyarországi terjedéséről és az új vírusváltozatok felbukkanásáról – összegzi Kintses Bálint és Papp Balázs a projekt fő célkitűzését.
A mintagyűjtés a Magyar Honvédség Egészségügyi Központja (Lengyel György, Nagy Ágnes, Pereszlényi Csaba, Babinszky Gergely, Dudás Gábor), a Szegedi Tudományegyetem Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Intézete (Terhes Gabriella, Burián Katalin), a Debreceni Egyetem Klinikai Központja (Csoma Eszter), a Pécsi Tudományegyetem Szentágothai János Kutatóközpontjához tartozó Virológiai Nemzeti Laboratórium, valamint az Avidin kft. (Puskás László) közreműködésével történik. A mintákból kinyert koronavírus örökítőanyagának szekvenálását (genomikai elemzését) a Virológiai Nemzeti Laboratóriumban prof. dr. Jakab Ferenc, valamint dr. Kemenesi Gábor és munkacsoportjuk végzi, akik az országban elsőként és világviszonylatban is az első tíz ország között végezték el a SARS-CoV-2 vírus teljes génszerkezetének (génszekvencia, vagyis az örökítőanyagot felépítő bázisok sorrendje) meghatározását egy általuk kidolgozott, optimalizált, új módszerrel. A genomszekvenciák bioinformatikai elemzését – dr. Kintses Bálint és dr. Papp Balázs vezetése mellett – dr. Ari Eszter, az ELKH-SZBK tudományos munkatársa és az Eötvös Loránd Tudományegyetem Genetikai Tanszékének adjunktusa, illetve dr. Vásárhelyi Bálint Márk, ELKH-SZBK tudományos munkatársa végzik.
Közel 300 hazai vírusváltozatot elemeztek
A kutatócsoport mostanáig mintegy 270 hazai vírusváltozat genetikai feltérképezését végezte el: a tavaszi járványhullám során 85, míg az őszi, második hullámban 188 koronavírus-mintát vontak be a vizsgálatba (1. ábra).
– Munkánk során a hazai vírusgenomokat a világ más országaiban izolált vírusváltozatokhoz hasonlítottuk, és ún. evolúciós törzsfát építettünk a szakterület legfrissebb protokolljait követve (ld. a módszertan bemutatását alább). Az elemzések alapján kideríthető, hogy melyik hazai vírusváltozat melyik másikkal mutat közelebbi rokonságot és a legutóbbi közös ősük vajon jelen volt-e már Magyarországon. A vírusváltozatok ez utóbbi csoportját hazai “kládoknak” nevezzük, és különösen fontosak, mert hazai terjedésű fertőzési láncolatot jeleznek. A tavaszi hullámból vizsgált 85 minta elemzése azt mutatja, hogy a Magyarországra behurcolt fertőzések számos, egymástól független behozatalból származnak, amit a leszármazási fán a magyar minták szétszórt megjelenése szemlélet – magyarázza Ari Eszter bioinformatikus.
![2. ábra. Evolúciós törzsfa: a SARS-CoV-2 vírus változatai és terjedésük időskálával ellátott leszármazási fán ábrázolva. A szekvenciákat 2020 november 11-én töltöttük le a GISAID adatbázisból [3]. Piros ágakkal és minta névvel a magyar, sárgával az afrikai, barnával az ázsiai, sötétzölddel a nem magyar európai, világos kékkel az észak-amerikai, világoszölddel a dél-amerikai és sötétkékkel az ausztráliai, óceániai származású genomokat jelöltük. A belső ágak eredete nem egyértelműen meghatározható, szürke színnel jelöltük őket. Az első hullámban megjelenő magyar kládok kék, a második hullámban megjelenők piros hátterű kiemelést kaptak és Hun A, …, Hun J névvel utalunk rájuk. A Pangolin besorolások [4] szerinti vonalakat két színskálán mutatjuk be a fa jobb oldalán.](images/2.Abra_kicsi.png)
A törzsfa és a vizsgált magyar genomok főbb adatai letölthetők innen. A 2. ábra nagyfelbontású verziója itt érhető el.
Mi történt tehát tavasszal?
Az evolúciós törzsfát elemezve megállapítható, hogy az észlelt magyarországi behozatalok jellemezően február végén és március első felében történhettek – abban az időszakban, amikor az első fertőzések felütötték a fejüket Nyugat-Európában (piros vonalak kezdete az 2. ábrán). Ez a megállapítás egyben azt is igazolja, hogy hibás az az általános népvélekedés, miszerint a vírus már korábban is terjedt volna hazánkban. Az evolúciós törzsfa adatai szerint (1. táblázat) március előtt lényegében nem volt igazolt hazai terjedése a vírusnak, ami egybecseng más járványügyi adatokkal. Természetesen nem zárhatjuk ki teljes bizonyossággal, hogy nem volt olyan fertőzési góc az országban, amely esetlegesen már korábban megjelent, csak mikrobiológiai vizsgálat hiányában nem került leírásra. Az viszont szinte bizonyos, hogy ha előfordultak is ilyen szórványos esetek, ezek nem váltak dominánssá, vagyis nem terjedtek szét a tavaszi hullám során.
| Név | Legutolsó közös ős becsült dátuma | Terjedés hossza (napok) | Méret (mintaszám) | Megyék | Pangolin besorolás1 | Mely országokban terjedt el a Pangolin besorolás szerinti vonal2 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Hun A | 2020-03-20 | 56 | 15 | Pest | B.1.1 | Egyesült Királyság, USA, Portugália |
| Hun B | 2020-03-31 | 23 | 4 | Borsod-Abaúj-Zemplén, Heves | B.1.1 | Egyesült Királyság, USA, Portugália |
| Hun C | 2020-03-26 | 14 | 3 | Hajdú-Bihar | B.1.1 | Egyesült Királyság, USA, Portugália |
| Hun D | 2020-04-05 | 61 | 7 | Pest | B.1.5, B.1 | Egyesült Királyság, USA, Spanyolország; Franciaország |
| Hun E | 2020-03-12 | 18 | 4 | Budapest, Csongrád | B.1.5 | Egyesült Királyság, USA, Spanyolország |
| Hun F | 2020-03-07 | 22 | 3 | Csongrád | B.1 | Egyesült Királyság, USA, Franciaország |
| Hun G | 2020-07-08 | 55 | 20 | B.1.1.70 | Egyesült Királyság, Svájc, Szerbia | |
| Hun H | 2020-07-28 | 35 | 11 | B.1.1.15 | Egyesült Királyság, Portugália, Luxembourg | |
| Hun I | 2020-08-12 | 22 | 3 | Hajdú-Bihar | B.1.1, B.1.5 | Egyesült Királyság, USA, Portugália; Spanyolország |
| Hun J* | 2020-07-04 | 113 | 132 | Baranya, Borsod-Abaúj-Zemplén, Győr-Moson-Sopron, Hajdú-Bihar, Heves, Pest, Somogy, Szabolcs-Szatmár-Bereg, Veszprém | B.1.160, B.1.162, B.1 | Egyesült Királyság, Szaúd-Arábia, India; USA, Kanada, Franciaország |
| 1 Amennyiben a magyar minták genomjai több Pangolin kategóriába tartoztak, akkor a gyakoribb kategóriákat írtuk előre. | ||||||
| 2 Amennyiben a magyar minták genomjai több Pangolin kategóriába tartoztak, akkor a gyakoribb kategóriák elterjedési országait írtuk előre. | ||||||
| * Az összes európai genom vizsgálata alapján feltételezhető, hogy a Hun J két független behurcolás eredménye is lehet. |
Az evolúciós leszármazási analízis azt mutatja, hogy a márciusban hazánkban terjedő vírusváltozatok megegyeznek az az idő tájt Európa más országaiban is széles körben terjedő változatokkal (B.1 jelölésű leszármazási vonal). Mivel ezeket a változatokat leghamarabb Olaszországban figyelték meg, ezért mondhatjuk, hogy hazánkban is az Olaszországból kiinduló változatok terjedtek.
A március 17-i határzárat megelőző vírusbehhurcolások több hazai kládot, azaz hazai terjedésű fertőzési láncot alakítottak ki. A 85 tavaszi vírusminta vizsgálatai azt jelzik, hogy a járvány első szakaszában legalább 6 független klád jelenléte igazolható a magyar lakosság körében (a 2. ábrán kék háttérszínnel kiemelve, lásd 1. táblázat). Ezek a kládok jellemzően rövidek. A leghosszabb mintavételezett terjedési lánc (Hun A) két hónapot fed le. Az egyes megyékben megjelenő kládok jellemzően nem terjedtek át másik megyére, tehát az első járványhullám fertőzési láncai lokálisak maradtak. Ebből pedig arra lehet következtetni, hogy a járványügyi intézkedések hatásosak voltak, a tavasszal behurcolt fertőzések továbbterjedését sikerült megfékezni.
Független-e a járvány újbóli fellángolása a tavaszi első hullámtól?
A július elejétől augusztus közepéig fokozatosan csökkenő, majd ismét emelkedő tendenciát mutató napi esetszámok azt jelzik, hogy az újabb járványhullám nyár közepén indult.
– Vizsgálatunk azt igazolja, hogy a jelenlegi, második járványhullám nem a tavaszi időszakban kialakult és hazánkban lappangva terjedő fertőzési láncok folytatásaként jött létre. Ellenkezőleg: a határ megnyitását követően, a nyár közepén újbóli behurcolások történtek az országba (a 2. ábrán piros háttérszínnel kiemelt júliusi láncok máshol jelennek meg a fán) – magyarázza Papp Balázs. Összhangban a nyilvánosságra hozott epidemiológiai adatokkal, júliusban és augusztus elején nagy volt az új esetek között a külföldről behurcolt fertőzések aránya.
Kutatási eredményeink arra is rámutatnak, hogy – ellentétben a tavaszi hullámmal – a július–augusztus folyamán behurcolt esetekből jelentős terjedési láncolatok alakultak ki, és az ősz elején megfigyelt napi esetszám-emelkedés jellemzően ezeknek a korai behurcolási eseményeknek köszönhető. Lényeges különbség a járvány két szakasza között, hogy a 2. hullám kládjai időben sokkal kiterjedtebbek (akár több hónapig is elhúzódik egy-egy vírusváltozat terjedése), és egy-egy klád jellemzően sokkal több fertőzöttet foglal magában (lásd 1. táblázat). Ráadásul az egy kládon belüli minták jellemzően több megyéből érkeztek, tehát amíg az első hullám lokális maradt, addig a másodikban már van olyan klád is, ami országos kiterjedésű, főleg az észak-keleti régióban (Hun J). Ez megerősíti a belföldi széthurcolás szerepét abban az időszakban (nyár), amikor még elsősorban a külföldről történő behurcolás megállítására helyeződött a hangsúly (határzár). A tavaszi és az őszi hullám különbségei jól tükrözik, hogy a járványügyi korlátozások fontos szerepet töltenek be a fertőzés terjedésének megakadályozásában, illetve lassításában – fejtette ki a vírusgenomikai analízisekből levonható legfontosabb következtetéseket Kintses Bálint.
Ha megnézzük az evolúciós törzsfát, látható, hogy a fertőzés újbóli behozatalát és a behurcolt vírusok szétterjedését támasztja alá az a tény is, hogy az őszi vírusváltozatok (B.1.1.70, B.1.160., B.1.1.15 jelölésű leszármazási vonalak) túlnyomórészt nem egyeznek meg a tavasszal terjedő változatokkal (B.1, B.1.1, B.1.5 leszármazási vonalak). A hazai őszi járványhullámot olyan változatok dominálják, amelyek a tavasz során más európai országokban alakultak ki a korai olaszországi fertőzési vonalak leszármazottaiként, tehát a második hazai járványhullám nagy valószínűséggel nem az első feléledése – nyomatékosítja Jakab Ferenc virológus professzor is.
Milyen koronavírus-változatok terjednek ma hazánkban?
A Magyarországon jelenleg terjedő vírusváltozatok alapvetően megegyeznek az Európában terjedő vírusváltozatokkal. A legnagyobb magyar kládot (Hun J) kialakító változat (B.1.160. leszármazási vonal) például az Egyesült Királyságban is megtalálható, de emellett több európai országban – köztük Dániában, Svájcban, Szerbiában és Luxemburgban – is megfigyelték a hazánkban jelenleg terjedő variánsokat
Van-e jelentősége a vírus mutációjának a terjedés vagy a megbetegedés szempontjából?
Az eddigi tapasztalatok azt mutatják, hogy a koronavírus genomjában megjelenő mutációk döntő többségének nincs hatása a vírus biológiai viselkedésére. Ennek ellenére időnként bekövetkeznek olyan mutációk, amelyek befolyásolják a vírus fertőzőképességét vagy szervezetbeli viselkedését, ezért nagyon fontos, hogy detektálni tudjuk ezek felbukkanását és folyamatosan nyomon kövessük a terjedésüket. Ezt a célt szolgálja a WHO által létrehozott és működtetett GISAID adatbázis, amelyben az influenzavírusok mellett immár a COVID-19 megbetegedésért felelős kórokozó génszekvencia-adatait, továbbá a kapcsolódó klinikai és járványügyi (epidemiológiai) adatokat gyűjtik a világ minden országából. A magyarországi Virológiai Nemzeti Laboratórium jelenleg is együtt dolgozik a nemzetközi szervezettel, így a hazai adatok a nemzetközi vírusmonitorozásnak is fontos elemei – mutat rá Jakab Ferenc.
– Több nemzetközi kutatás is utal arra, hogy a vírus felszíni tüskefehérjéjében a D614G mutációt tartalmazó változat valamelyest fertőzőbb, mint az eredetileg Kínában kialakult vírus. Ugyanakkor, a mutáció vírusterjedésre gyakorolt hatásáról még keveset tudunk [5]. Az is igazolható ugyanakkor, hogy a magyarországi első hullámot már szinte kizárólag ez a változat okozta, ezért az őszi járványhullám nagyobb kiterjedtségét ez a mutáció önmagában nem magyarázhatja – tudtuk meg Kemenesi Gábor vírológustól, a Virológiai Nemzeti Laboratórium munkatársától. – Egy másik említésre méltó mutációról kimutatták, hogy képessé teheti a vírust az immunrendszer kikerülésére. Ez a mutáció (N439K) szintén a vírus tüskefehérjéjét módosítja, aminek következtében az immunrendszer által termelt antitestek kevésbé képesek megkötni és semlegesíteni a kórokozót. Könnyen belátható, hogy egy ilyen mutáció kihívást jelenthet az oltási programok és az antitestbevitelen alapuló gyógyszeres kezelés számára. Habár a N439K mutáns vírusvariáns jelenleg 12 országban van jelen, szerencsére hazánkban csak egy mintában bukkant fel eddig és nem terjedt el.
Fontos kiemelni, hogy a SARS-CoV-2 koronavírus genetikai állománya ugyan folyamatosan változik, de ez a változás viszonylag lassú folyamat más vírusok – például az influenzavírus – genetikai módosulásaihoz képest. Ennek köszönhetően a kutatók szerint az oltások fejlesztését egyelőre nem fenyegeti veszély, de a jövőbeli járványügyi eseményekre való felkészülés szempontjából lényeges szerepe van az új vírusváltozat valós idejű követésének. Így például az antitest-terápia optimális megválasztását nagyban segítheti, ha ismerjük, hogy egy adott földrajzi régióban milyen vírusváltozatok keringenek. Mivel a betegellátásban többféle terápiás antitest is rendelkezésre áll, egy adott antitestnek ellenálló vírusváltozat észlelése esetén jó alternatívát jelenthet egy másik antitest alkalmazása [6].
– Fontos megemlítenünk, hogy az eddig vizsgált genomok nem országos lefedettségűek, így elsősorban az északkelet-magyarországi régiót és a nagyobb egyetemi városokat reprezentálják. A hazai kollaborációs projekt célja, hogy hosszabb távon az eddigieknél reprezentatívabb módon és a lehető legtöbb genom elemzésével kövessük a Magyarországon terjedő koronavírus-változatokat – összegezte Kintses Bálint a kutatómunka távlati rendeltetését.
A bemutatott kutatásról a Kutatók éjszakájára készült videót itt tekintheti meg.
Kutatásmódszertan
A magyar koronavírus-genomok szekvenálása
A vírusmintákat az ARTIC network [7] szerinti ajánlás alapján, Oxford Nanopore MinION eszközön szekvenáltuk.
Bioinformatikai elemzés
A 273 magyarországi minta mellett az elemzéshez a GISAID [3] adatbázisban 2020. november 11-én elérhető, csaknem 200 000 SARS-CoV-2 genomszekvenciát is felhasználtuk. A leszármazási vonalak behozatali idejének becslése nagyon számításigényes, ezért a genome-sampler [8] alkalmazás segítségével a nem magyar mintaszámot 800 – idő és változatosság szerint – reprezentatív genomra csökkentettük. A szekvenciákat a Nexstrain Augur keretrendszerben [9] elemezve MAFFT szoftverrel [10] illesztettük, és a Nick Goldman kutatócsoportja általi ajánlások szerint [11] maszkoltuk azokat a régiókat, amelyek félrevezethetik az elemzéseket. A vírugenomokat a Pangolin program [4] segítségével soroltuk leszármazási vonalakba, amely Andrew Rambaut kutatócsoportjának munkáján [12] alapszik.
Az időskálán elhelyezett filogenetikai fát a Bayes módszeren alapuló BEAST 1.10-es programcsomaggal [13] számoltuk, követve cikkegy korábbi koronavírus filogenetikai munka [14] protokollját. A magyar kládokat (magyarországi közös őssel bíró vírusváltozatokat), egy korábbi cikk [15] alapján a következőképpen definiáltuk: (1) egy kládba legalább 3 magyar szekvencia tartozik, (2) a klád alátámasztottsága (0 és 1 közé eső poszterior valószínűség) 0,8 feletti, (3) a kládban legalább 75%-ban magyar minták vannak.
Hogy megbizonyosodjunk afelől, hogy a BEAST-tel kimutatott magyar kládok valóban egyedi behurcolások eredményeként jöttek létre, még egy további, jóval több európai vírusmintát (több mint 12 000 genomot) elemző maximum-likelihood módszeren alapuló fát is építettünk az IQTree2 szoftver [16] segítségével. A filogenetikai fákat a ggtree R programcsomaggal [17] ábrázoltuk.
Köszönettel tartozunk dr. Bokor Dórának a közlemény megírásában nyújtott segítségéért.
1. Callaway E. The coronavirus is mutating — does it matter? Nature 2020; 585(7824):174–177.
2. Rohde RE. What monoclonal antibodies are – and why we need them as well as a vaccine. The Conversation 2020.
3. Elbe S, Buckland-Merrett G. Data, disease and diplomacy: GISAID’s innovative contribution to global health. Global Challenges 2017; 1(1):33–46.
4. Pangolin. github.com/cov-lineages/pangolin. 2020.
5. Volz EM, Hill V, McCrone JT és mtsai. Evaluating the effects of SARS-CoV-2 Spike mutation D614G on transmissibility and pathogenicity. medRxiv 2020:2020.07.31.20166082.
6. Thomson EC, Rosen LE, Shepherd JG és mtsai. The circulating SARS-CoV-2 spike variant N439K maintains fitness while evading antibody-mediated immunity. bioRxiv 2020:2020.11.04.355842.
7. ARTIC N. nCoV-2019 sequencing protocol, 2020. doi:10.17504/protocols.io.bbmuik6w.
8. Bolyen E, Dillon MR, Bokulich NA és mtsai. Reproducibly sampling SARS-CoV-2 genomes across time, geography, and viral diversity. F1000Research 2020; 9:657.
9. Hadfield J, Megill C, Bell SM és mtsai. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics 2018; 34(23):4121–4123.
10. Nakamura T, Yamada KD, Tomii K, Katoh K. Parallelization of MAFFT for large-scale multiple sequence alignments. Bioinformatics 2018; 34(14):2490–2492.
11. De Maio N, Walker C, Borges R és mtsai. Masking strategies for SARS-CoV-2 alignments. Virological 2020.
12. Rambaut A, Holmes EC, O’Toole Á és mtsai. A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology. Nature Microbiology 2020; 5(11):1403–1407.
13. Suchard MA, Lemey P, Baele G és mtsai. Bayesian phylogenetic and phylodynamic data integration using BEAST 1.10. Virus Evolution 2018. doi:10.1093/ve/vey016.
14. Lu J, Plessis L du, Liu Z és mtsai. Genomic Epidemiology of SARS-CoV-2 in Guangdong Province, China. Cell 2020; 181(5):997–1003.e9.
15. Candido DS, Claro IM, Jesus JG de és mtsai. Evolution and epidemic spread of SARS-CoV-2 in Brazil. Science 2020; 369(6508):1255–1260.
16. Minh BQ, Schmidt HA, Chernomor O és mtsai. IQ-TREE 2: New Models and Efficient Methods for Phylogenetic Inference in the Genomic Era. Molecular Biology and Evolution 2020; 37(5):1530–1534.
17. Yu G, Smith DK, Zhu H és mtsai. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution 2017; 8(1):28–36.